今天是  
用户名: 密 码:
关健字

欢迎大家来到植物组培网----植物组织培养行业门户网站。

 
  当前位置:首页 > 组培课堂 >
组织培养过程示例
日期:2010年4月1日 来源:互联网 作者:植物组培网 点击:12226
 
组织培养步骤
1、培养基配制
 
 
母液
品名
MS配方
mg/L
100倍母液用量
mg/L
母液1
硝酸铵
1650
165000
母液2
硝酸钾
1900
190000
母液3
硫酸镁
370
37000
母液4
二水氯化钙
400
40000
母液5
磷酸二氢钾
170
17000
母液6
EDTA二钠
37.3
3730
硫酸亚铁
27.8
2780
母液7
碘化钾
0.83
83
硼酸
6.2
620
一水硫酸锰
16.9
1690
硫酸锌
8.6
860
钼酸钠
0.25
25
硫酸铜
0.025
2.5(称50mg配成100ml,配培养基时取5ml)
氯化钴
0.025
2.5(称50mg配成100ml,配培养基时取5ml)
母液8
肌醇
100
10000
烟酸
0.5
50
VB6
0.5
50
VB1
0.1
10
甘氨酸
2
200
      按照上表配成100倍母液8种,各配成1L,各种母液配完后,分别用玻璃瓶贮存,并且贴上标签,注明母液号、配制倍数、日期等,保存在冰箱的冷藏室中
MS培养基中还需要加入萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)等植物生长调节物质,并且分别配成母液(1 mg/mL)。其配制方法是:分别称取这2种物质各100mg, NAA用少量乙醇溶解,6-BA用少量的NaOH溶液,溶解过程需要水浴加热,最后分别定容至100 mL,即得1mg/mL的母液。
1当量氢氧化钠:称取4g氢氧化钠,加蒸馏水定容到100mL。
1当量盐酸:量取浓盐酸9mL,加蒸馏水定容到100mL。
以配制1L培养基为例:
用量筒或移液管从各种母液中分别取出10ml, 与各种母液一起放入烧杯中。然后量取所需浓度的NAA或6-BA加入烧杯中,称取蔗糖30g,加入烧杯后,定溶到1L。
调pH值  用酸度计或PH试纸测溶液PH值(可用1当量的氢氧化钠和1当量的盐酸调节PH值直到培养基的pH为5.8为止),培养基的pH必须严格控制在5.8。
称取5g左右琼脂粉倒入烧杯中,然后在电炉上加热,边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状。
培养基的分装  溶化的培养基应该趁热分装。将烧杯中的培养基倒入培养瓶中,注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。每1L培养基,可分装25~30瓶。
培养基分装完毕后,用硫酸纸或封口膜及时封盖瓶口。如果组培瓶有盖则盖上盖子。
培养基参考:
增殖培养基:MS+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉 5g/L
生根培养基:MS+ NAA0.2+蔗糖30g/L+琼脂粉 5g/L
培养基配方是在不断实践摸索中,才能找到最适合的培养基。
 
2、培养基灭菌
将分装好的培养基放入高压蒸气灭菌锅灭菌
    培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅内,其中的蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下,锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
    注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,通电后,待压力上升到0.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。
    关阀再通电后,压力表上升达到0.1MPa时,开始计时,维持压力0.1-0.15MPa,20分钟。
到达保压时间后,即可切断电源,在压力到0.5MPa,可缓慢放出蒸汽,应注意不要使压力降低太快,以致引起激烈的减压沸腾,使容器中的液体四溢。当压力降到零后,才能开盖,取出培养基,摆在平台上,以待冷凝。不可久不放气,引起培养基成分变化,以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久,由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开,大气压入,内外压力平衡,盖子便易打开了
灭好菌后,让培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用
3、接种
植物材料表面用消毒剂灭菌
    从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接种到培养基上,这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体(explant)。
    首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。
    洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面活性物质吐温。
    第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。
    第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1-2种使用见下表。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较
灭菌剂名称
使用浓度%
消毒难易
灭菌时间
灭菌效果
氯化汞
0.1-0.2
较难
2-10
最好
漂白粉
饱和溶液
5-30
很好
次氯酸钠
2(活性氧)
5-30
很好
过氧化氢
10-12
最易
5-15
    上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的;过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小,灭菌后用无菌水漂洗3-4次即可;由于升汞液灭菌的材料,难以对升汞残毒去除,所以应当用无菌水漂洗8-10次,每次不少于3分钟,以尽量去除残毒。
    灭菌时,不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒入消毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。在快到时间之前1-2分钟,开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内,要注意勿使材料倒出,氢净后立即倒入无菌水,轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果,以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
    在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的0.5%,即在100ml加入15滴。
    最后一步是用无菌水漂洗,漂洗要求3分钟左右,视采用的消毒液种类,漂洗3-10次左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
接种在超净台上操作,接种前超净台上和接种间的紫外线灯开30分钟以上杀菌。
在无菌操作时,把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后,立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶,放入95%的酒精,以便插入工具。
 
 
接种步骤
1)将初步洗涤及切割的材料放入烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。
(2)材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。
(3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程(以试管为例)是:先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,使试管口靠近酒精灯火焰,并将管口在火焰上方转动,使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口,可先在管口外面灼烧,去掉棉塞,再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上,以放1-3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外,其他尚无统一要求。接种完后,将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞,塞好后,包上包口纸,包口纸里面也要过火。
4、培养
接种好后,放入组培室培养,一般温度控制在25℃左右,光照12-16小时左右。
 
时间:2010年4月1日 点击:12226  关闭窗口
 组培课堂
   母液和培养基的配制
   组织培养的方法和步骤
   组织培养中的清洗、消毒灭菌技术
   培养物的不良表现及措施
   组培苗的褐化问题
   组培苗的玻璃化问题
   组培苗的黄化问题
   组织培养过程示例
   常用植物生长调节剂
 组培技术
   母液和培养基的配制
   组织培养的方法和步骤
   组织培养中的清洗、消毒灭菌技术
   培养物的不良表现及措施
   组培苗的褐化问题
   组培苗的玻璃化问题
   组培苗的黄化问题
   组织培养过程示例
   常用植物生长调节剂
 投票调查
您是如何得知本网站?
1 . 网上查询
2 . 报纸杂志
3 . 朋友介绍
4 . 其它路径
 友情连接

    农博网   
国际植物生物技术联合会 日本组织培养协会 孟加拉国组培协会 Home Tissue Culture Association Inc. Kitchen Culture Kits

中国食虫植物网   中国花卉网   中国农业网址大全   中国农业网   中国农户网

首页 | 联系方式